Tuba Büyüküstün 5 Temmuz 1982 tarihinde İstanbul'da doğdu. Anne tarafından Kırım göçmeni, baba tarafından ise Girit göçmeni kökenlidir. İstanbul Özel Doğuş Okulları'ndan ve Mimar Sinan Güzel Sanatlar Üniversitesi Sahne Dekorları ve Kostüm Tasarımı Bölümünden mezun oldu.
Üniversitede okurken reklam filmlerinde rol aldı. Üniversiteyi bitirdikten sonra yönetmen Tomris Giritlioğlu sayesinde oyunculuğa başladı 2003 yılında Aydın Bulut’un yönettiği ve Kanal D'de yayınlanan Sultan Makamı adlı dizinin son 4 bölümünde oynayarak dizi oyunculuğuna başladı.
2004 yılında Çağan Irmak’ın yönettiği ve Kanal D'de yayınlanan Çemberimde Gül Oya adlı dizide Zarife karakterini canlandırarak adından söz ettirdi. Yine aynı yıl Cemal Şan’ın yönettiği Gülizar adlı televizyon filminde Gülizar karakterini canlandıran Büyüküstün, bu 
rolüyle Sırbistan-Karadağ Uluslararası TV Festival Bar'da En İyi Kadın Oyuncu Ödülü'nü aldı. 2005 yılında Aydın Bulut'un yönettiği ve Kanal D'de yayınlanan Ihlamurlar Altında adlı dizide Bülent İnal ve Sinan Tuzcu ile başrolü paylaşarak büyük bir çıkış yaptı.
Aynı yıl Babam ve Oğlum adlı sinema filminde Aysun karakterini canlandırarak bir kez daha Çağan Irmak'la çalıştı ve sinemaya adım attı. 2006 yılında Ömer Faruk Sorak'ın yönettiği Sınav adlı sinema filminde oynayan Büyüküstün, bu filmde ünlü oyuncu 
Jean-Claude Van Damme ile çalışma fırsatı yakaladı. 2007 yılında Antakya'da çekilen, Cevdet Mercan'ın yönettiği ve Kanal D'de yayınlanan Asi adlı dizide Murat Yıldırım ve Çetin Tekindor'la başrolü paylaştı. Aynı yıllarda Çemberimde Gül Oya,
Ihlamurlar Altında, Asi gibi dizilerinin Arap televizyonlarında gösterilmesiyle birlikte, Orta Doğu'da büyük bir üne kavuştu ve Türk dizilerinin yurt dışına ihracında önemli bir rol oynadı. Başrolünü oynadığı Asi dizisi 
67 ülkedeki izlenme oranlarıyla, 51. Monte-Carlo Televizyon Festivali'nde En İyi Pembe Dizi kategorisinde aday gösterildi.2010 yılında Yusuf Kurçenli'nin yönettiği Yüreğine Sor filmiyle sinemada ilk başrolünü oynadı. Daha sonra atv’de
yayınlanan Gönülçelen adlı dizide, Cansel Elçin'le birlikte başrolü paylaştı. 2013 yılının ilk günlerinde, Star TV'de yayınlanmaya başlayan 20 Dakika adlı dizide İlker Aksum ile birlikte başrolü paylaşarak 1,5 yıl ara verdiği ekranlara
geri döndü. 20 Dakika dizisindeki rolüyle 42. Uluslararası Emmy Ödülleri'nde En İyi Kadın Oyuncu kategorisine aday gösterilerek Emmy'e aday olabilen ilk Türk oyuncu unvanını aldı.[5] 2014 yılında UNICEF Türkiye'nin iyi niyet elçisi seçilen 
Büyüküstün,yine 2014 yılının Mart ayında başlayan ve atv'de yayınlanan Kara Para Aşk dizisinde Engin Akyürek ile birlikte başrolü paylaştı. Kara Para Aşk dizisindeki rolüyle İhracatın Yıldızları ödülünü alırken, yine bu rolü ve 
yardımseverliği nedeniyle 14. Uluslararası Giuseppe Sciacca Ödülleri'nde En İyi Kadın Oyuncu seçildi. 2015 yılının son aylarında sinemaya ağırlık vererek, biri kısa film olmak üzere Orman, Rüzgarın Hatıraları ve 
Dar Elbise filmlerinde rol aldı. 2016 yılında ise Halit Ergenç, Mehmet Günsür, Nejat İşler gibi önemli oyuncularla birlikte ünlü yönetmen Ferzan Özpetek'in İstanbul Kırmızısı filminde oynayan Büyüküstün,
 Kasım ayında başlayan ve Star TV'de yayınlanmış Cesur ve Güzel dizisinde Kıvanç Tatlıtuğ ile birlikte başrolü paylaşmıştır. 2020 yılında ise internet platformu olan Netflix'te yayınlanan Rise of Empires: 
Ottoman dizisinde Mara Hatun'u canlandırmıştır. Yine 2020 yılında Star TV'de yayınlanan Menajerimi Ara dizisinde kendisini canlandırarak konuk oyuncu olmuştur ve 4 yıl aradan sonra TV ekranlarına geri dönmüştür. 
2021'de ise Star TV'de yayınlanan Engin Akyürek ve Neslihan Atagül'ün başrolünde olduğu Sefirin Kızı dizisinde Neslihan Atagül'ün sağlık sorunları nedeni ile diziden ayrılması üzerine diziye başrol olarak dahil olup 
Mavi karakterini canlandırdı.Son olarak netfilixde yayınlanan ve başrolunu Murat Boz,Seda Bakan,Boncuk Yılmaz'ında rol aldığı filmle sinema hayatına devam etmektedir.
28 Temmuz 2011 tarihinde kendisi gibi oyuncu olan Onur Saylak ile evlendi.19 Ocak 2012 tarihinde ikiz kızlarını dünyaya getirdi. Kızlarına Toprak ve Maya isimlerini verdi. Evlilikleri 5 Haziran 2017'de sona erdi